《分子生物学实验：实用操作技术与应用案例》共分为两部分。上篇重点介绍分子生物学常用实验技术，包括总RNA的提取和cDNA的合成、基因组DNA的制备和PCR反应、琼脂糖凝胶电泳和目的DNA片段回收、DNA的浓缩与目的片段的连接、细菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化、质粒DNA的提取和酶切、组织总蛋白提取、聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot分析、重组蛋白的表达和纯化、蛋白互作分析、农杆菌介导植物的遗传转化、抑制消减杂交、eDNA芯片杂交、染色质免疫共沉淀技术、凝胶阻滞分析等技术的原理及操作步骤。这些技术的来龙去脉及发展趋势在目前已经出版的很多书籍和综述中都有详细的介绍，因此《分子生物学实验：实用操作技术与应用案例》对这些内容只是作简明扼要的说明。下篇用了很大的篇幅介绍这些实验技术的应用实例，通过对这些具体应用实例的阅读和了解，使得刚开始接触和需要应用分子生物技术的学生或研究人员能很容易地理解这些实验技术的操作方法及应用过程中各环节的要求，并使其尽快入门，学会应用这些实验技术设计自己的实验方案。
《分子生物学实验：实用操作技术与应用案例》可作为从事生物学、医学、农学、环境生物学领域研究的学生及教学人员的参考用书。
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当前所有生命现象的研究都已深入到分子水平，分子生物学技术的应用也渗透到生物学相关学科的所有研究领域，并成为重要的研究方法和手段，这种形势要求生物学所有专业的本科生和研究生都要了解现代分子生物学的基础理论知识，掌握并学会应用分子生物学的实验技术及方法。将现代分子生物学设置为研究生的必修课，使他们能够掌握遗传信息的传递和表达机制，学会运用基本的实验技术对遗传物质进行实验操作，对于培养和训练他们的研究性思维大有益处。在给研究生开课的过程中，我们发现新进研究生由于缺乏实际应用分子生物学实验操作的经验和体会，因此很难理解和掌握现有课本上描述的各类分子生物学实验技术。为了提高研究生掌握和应用分子生物学实验操作技术的能力，并加强其对这些实验技术的应用体验，我们根据自己的研究经验及积累的实验操作方法和技术技巧编写了本书。本书系统汇总了目前分子生物学中较为实用的一些实验操作技术及应用实例，涉及的内容包括PCR产物的亚克隆技术及应用实例、原核表达载体的构建与应用实例、酵母细胞表达载体的构建与应用实例、利用通路克隆技术构建植物表达载体及应用实例、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化技术、酵母感受态细胞的制备与转化技术、常用转基因植物的遗传转化技术、基因插入情况与拷贝数的检测技术、基因表达水平的检测技术、差异表达基因的分离鉴定技术、转基因株系表型分析技术、蛋白质互作分析技术、转录因子的功能分析技术等。这些技术经过我们往届研究生的体验和反复应用及验证，确认为可操作性与实用性较强的技术。
本书可作为生物学、农学、医学、环境生物学专业的博士和硕士研究生及这些专业高年级本科生的参考用书，也可以作为新进研究生的实验培训教材和实验操作指南，使读者能及时掌握分子生物学实验操作技术。
目录
前言
上篇 实验操作技术
第一章 核酸分析与分子克隆技术 3
一、用PCR扩增目的DNA片段 3
二、琼脂糖凝胶电泳 9
三、DNA片段的回收 10
四、用乙醇沉淀法浓缩DNA 样品 11
五、目的DNA片段的连接 11
六、感受态细胞的制备 13
七、质粒DNA的转化 15
八、质粒DNA的提取 18
九、质粒的酶切 20
十、利用Gateway技术构建植物表达载体 21
十一、Southern杂交分析 21
第二章 蛋白质分析技术 23
一、植物组织总蛋白提取及含量的测定 23
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 24
三、Western blotting分析 26
四、Far Western blotting分析 28
五、重组蛋白的表达和纯化技术 29
六、蛋白兔抗的制备 31
七、蛋白互作分析实验技术 32
第三章 农杆菌介导的植物转基因操作技术 35
一、原理 35
二、实验操作流程 35
第四章 基因差异表达分析技术 40
一、抑制消减杂交 40
二、cDNA芯片杂交 48
第五章 DNA与蛋白互作分析技术 49
一、染色质免疫共沉淀技术 49
二、凝胶阻滞分析技术 51
下篇 应用案例
第六章 通路克隆技术入门载体的改造 57
一、含有Rubisco小亚基启动子和叶绿体基质定位序列的通路克隆入门载体的构建 57
二、通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建 63
三、通路克隆入门载体pENTR*-T-GFP的构建及功能验证 68
第七章 用Gateway技术构建目的基因的光诱导型植物表达载体 75
一、光诱导型GFP基因植物表达载体的构建 75
二、光诱导型GUS基因植物表达载体的构建 76
三、光诱导型hps/phi融合基因植物表达载体的构建 80
四、拟南芥细胞质型苹果酸脱氢酶基因AMDH 光诱导型植物表达载体的构建 84
第八章 用Gateway技术构建目的基因的组成型植物表达载体 89
一、GFP基因植物组成型表达载体的构建 89
二、短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因植物表达载体的构建 91
三、大豆14-3-3a基因(SGF14a)植物表达载体的构建 96
第九章 用Gateway 技术构建目的基因与报告基因融合植物表达载体 100
一、大豆转录因子GmbHLH30与GF 融合基因植物表达载体的构建 100
二、拟南芥RCA启动子和荧光素酶基因LUC 融合表达载体的构建及应用 104
第十章 用Gateway技术构建目的基因的RNAi干扰植物表达载体 113
蚕豆PP1c基因抑制表达载体的构建与应用 113
第十一章 用Gateway技术构建串联两个目的基因表达盒的植物表达载体 118
二羟基丙酮合成酶和二羟基丙酮激酶基因表达盒串联的植物表达载体构建 118
第十二章 用经典的酶切连接技术构建目的基因的植物表达载体 128
一、柠檬酸合成酶基因cs光诱导型植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs的构建 128
二、芹菜丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体构建 132
第十三章 利用植物表达载体转化植物及转基因植物表型分析 136
一、用GFP 和GUS 植物表达载体产生转基因植物及转基因的整合与表达分析 136
二、用植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi转化天竺葵获得转基因植株及表型分析 141
三、用植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS转化拟南芥获得转基因植株及表型分析 145
四、用植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs转化烟草获得转基因植株及表型分析 156
五、用植物表达载体p1300-Surperpromoter-AgSAT转化烟草及转基因植株表型分析 160
六、利用CS和PEPC的表达载体产生双转基因烟草及表型分析 163
第十四章 原核表达载体的构建和应用 170
一、恶臭假单胞菌谷胱甘肽-非依赖型甲醛脱氢酶的原核表达载体的构建和应用 170
二、黑大豆醛脱氢酶基因原核表达载体的构建和应用 175
第十五章 酵母表达载体的构建及应用 181
AtHSFA1d基因在酵母中的表达与功能分析 181
第十六章 利用SSH-cDNA文库技术分析基因的差异表达 185
一、喷施甲醇的蚕豆叶片中上调表达基因的分离与鉴定 185
二、甲醛胁迫拟南芥叶片中下调表达基因的分离与鉴定 188
第十七章 利用DNA芯片技术分析基因的差异表达 191
一、用拟南芥全基因组芯片杂交分析基因的差异表达 191
二、用大豆全基因组芯片杂交分析基因的差异表达 194
第十八章 利用免疫共沉淀技术分析体内蛋白与蛋白之间的的相互作用 199
一、用免疫共沉淀分析铝胁迫下大豆根中14-3-3蛋白对质膜H+-ATPase 活性的调控 199
二、用免疫共沉淀分析烟草质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的互作对干旱胁迫的应答 203
三、用免疫共沉淀分析云南红梨果皮转录因子MYB、bHLH 和WD40的互作模式 207
第十九章 利用双分子荧光技术分析植物体内转录因子间的相互作用 209
在洋葱表皮细胞中验证PyMYB、PybHLH 和PyWD40之间的相互模式 209
第二十章 用Pulldown 和Far Western blot技术做体外实验分析蛋白质之间的互作 213
PyMYB、PybHLH和PyWD40重组蛋白之间互作模式分析 213
第二十一章 用ChIP分析植物体内转录因子和启动子的结合 218
一、云南红梨果皮MYB转录因子结合花青素结构基因启动子元件的分析 218
二、甲醇和乙醇刺激对烟草转录因子RSG与GA20ox1启动子结合的影响 224
第二十二章 利用EMSA技术做体外实验分析转录因子和基因启动子元件的结合 229
EMSA分析在体外PyMYB与花青素合成结构基因启动子的结合 229
第二十三章 利用PCR技术筛选拟南芥的T-DNA插入突变体 231
一、拟南芥SHMT1纯合T-DNA插入突变体的筛选 231
二、拟南芥HY5纯合T-DNA插入突变体的筛选 232
三、拟南芥bHLH30纯合T-DNA插入突变体的筛选 234
参考文献 237
附录 240
一、常用抗生素贮存液配制方法 240
二、常用培养基的配制 241
三、常用菌种的特性 244
四、常用质粒载体图谱 246
五、转基因生物表型常见生理生化指标的分析方法 264
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